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| Provedor de dados: |
OceanDocs
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| País: |
Belgium
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| Título: |
Bonamia sp. (Protozoa, Haplosporidia) parásito de Ostrea puelchana D’Orbigny, (Mollusca, Bivalvia) en el Golfo San Matías (Patagonia Argentina): Histopatología, identificación e infección
Bonamia sp. (Protozoa, Haplosporidia) parasite of Ostrea puelchana D'Orbigny, (Mollusca, Bivalvia) in San Matias Gulf (Argentinean Patagonia) : Histopathology, identification and infection
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| Autores: |
Kroeck, M.A.
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| Data: |
2013-12-13
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| Ano: |
2005
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| Palavras-chave: |
Fishery biology
Marine molluscs
Parasitology
Protozoan diseases
Histopathology
Spatial distribution
Environmental conditions
Methodology
Examinations
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| Resumo: |
Los moluscos bivalvos son organismos sedentarios que establecen una relación íntima no sólo entre ellos, sino también con el espacio que ocupan y con sus condiciones fisicoquímicas. Sus poblaciones pueden ser hospedadoras de múltiples organismos patógenos (virus,bacterias, hongos, protistas y metazoos), cuya presencia es regulada eficazmente a niveles infra, meta y suprapoblacionales en ambientes silvestres, no provocando, salvo excepcionalmente, impactos severos. Los cultivos a escala comercial producen concentraciones de individuos, con la consiguiente alteración del medio y del equilibrio natural en la relación parásito-hospedador, generándose condiciones apropiadas para el desarrollo de enfermedades. Entre los años 1995 y 1996 se instala, en la zona de la Bahía de San Antonio (Río Negro, Argentina), una empresa para iniciar los primeros cultivos comerciales de la ostra plana autóctona, Ostrea puelchana D’Orbigny. A los 18 meses de iniciado el cultivo se detectan mortalidades anormales que en un año afectan al 95% de los especimenes. Al realizar análisis histológicos, tanto de ostras silvestres como cultivadas, se observa la presencia de un protozoo parásito “tipo Bonamia”. En esta tesis se presentan resultados de estudios realizados sobre ejemplares pertenecientes a poblaciones de O. puelchana de cultivos y de bancos naturales del Golfo San Matías (Río Negro) colectados entre 1996 y 2002 con el propósito de detectar, identificar y caracterizar al agente patógeno asociado a las mortalidades en el área de cultivo. En septiembre de 1996 y octubre de 1997 se tomaron muestras del cultivo comercial de O. puelchana dentro de la Bahía de San Antonio. Paralelamente, y hasta octubre de 1998, se realizaron muestreos durante el otoño y la primavera, colectándose ejemplares en cada estación, en los bancos naturales de Reparo y Las Grutas. A partir de marzo de 1999 y hasta octubre del 2001, se incorporaron al monitoreo otros tres bancos naturales: El Sótano, Bajo Oliveira y Playa Orengo. Todas las muestras (n=30) fueron colectadas por buceo autónomo. Para la detección y la determinación del parásito se emplearon Técnicas de Diagnóstico Citológicas (Improntas de tejido cardíaco), Histológicas (Histología de partes blandas) y Moleculares (Reacción en Cadena de la Polimerasa e Hibridación in situ). Se utilizaron métodos epidemiológicos para validar la utilización de las distintas técnicas y estudios de parámetros parasitarios con aplicación de tests estadísticos paramétricos y no paramétricos para caracterizar la infección a nivel poblacional. La presencia de lesiones branquiales tales como indentaciones o escotaduras que comprometen parte de las lamelas es el principal signo macroscópico y el único, estadísticamente significativo respecto de la presencia de enfermedad. Sobre 300 ejemplares analizados, provenientes de Banco Reparo, el 23% presentaron estas lesiones con distintos grados de severidad, de los cuales el 10% estaban parasitados. No se registró presencia de pústulas y sólo excepcionalmente, cambio de coloración en la glándula digestiva. La infección se caracteriza por infiltraciones hemocitarias en tejido conectivo, tanto alrededor del complejo digestivo como en branquias con presencia de hemocitos parasitados o no. El parásito se localiza intracelularmente encontrándose desde 1 a 7 ejemplares por hemocito. Cuando la intensidad parasitaria es alta, los hemocitos infectados pueden encontrarse diseminados en todos los tejidos. También, se observan células “tipo Bonamia” libres en el espacio intercelular, probablemente liberadas por la ruptura o lisis de las células afectadas. Durante el periodo de estudio se pudo observar que el patógeno presenta dos tipos celulares: formas basófilas y formas acidófilas. Las primeras se caracterizan por su forma esférica u ovoide, citoplasma basófilo y núcleo central eosinófilo; miden aproximadamente 2 a 5 Sm de diámetro. Las segundas tienen un diámetro aproximado de 3 a 5Sm, son levemente basófilas y/o acidófilas, esféricas con bordes regulares, y poseen núcleo central fuertemente acidófilo. Ambos tipos celulares se encuentran tanto en otoño como en primavera, las formas basófilas se observan con más frecuencia en otoño y las acidófilas, principalmente en primavera. En las muestras tomadas de los cultivos, en septiembre de 1996 y octubre de 1997, se observaron sólo las formas basófilas. Este último tipo de células se correspondería con las formas densas o de resistencia descriptas en otras especies de Bonamia y podrían ser las responsables de la diseminación de la infección en los bancos de ostras. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), realizada con cebadores (primers) específicos para Bonamia, produjo amplificación sólo en las ostras que se encontraban parasitadas con las células “tipo Bonamia” observadas en las secciones histológicas. La técnica de Hibridación in situ, usando sondas Bonamia-específicas marcadas, también produjo hibridación sólo en las estructuras que, en las secciones histológicas, se correspondieron con células “tipo Bonamia”, confirmando que éstas pertenecen al género predicho. Además, la secuenciación genética de los productos de la PCR produjo una secuencia simple del ADN ribosomal (SSU rDNA) de Bonamia sp. Las características de la infección, los análisis citológicos, histológicos y moleculares confirman que el parásito “tipo Bonamia” hallado en ejemplares de Ostrea puelchana, procedentes de cultivo y de bancos naturales del Golfo San Matías, es una especie perteneciente al género Bonamia (Protozoa, Haplosporidia). Sería necesario, en trabajos futuros, realizar la secuencia genética completa de la SSU rDNA para determinar si es una especie nueva o se trata de una de las especies ya conocidas. Las evaluación de las cuatro técnicas de diagnóstico utilizadas para detectar Bonamia sp. en O. puelchana por métodos epidemiológicos y el estadístico kappa indican que tanto las improntas de tejido cardíaco como las secciones histológicas son igualmente buenas para la detección del parásito, siendo la primera más específica y la segunda, más sensible. Los valores de kappa para la Reacción en Cadena de la Polimerasa e Hibridación in situ indican un ajuste considerable entre estas técnicas y las tradicionales. Ostrea puelchana se infecta independientemente de su sexo y generalmente, de su talla con Bonamia sp. Además, el 47,5% de las hembras parasitadas se encontraban en estadio de desove. La aparición de la infección al coincidir con el inicio de la funcionalidad de la fase femenina, sugeriría una propagación de la infección relacionada con la condición de desove. Espacial y temporalmente, la infección mostró un claro patrón de propagación desde la zona de cultivo hacia los bancos naturales ubicados dentro del Golfo San Matías. El inicio de la infección se ubica en la zona de cultivos y se propaga hacia el sudeste y el noroeste del Golfo y aunque, sigue aproximadamente el mismo patrón en todos los bancos, existen diferencias significativas de los valores entre los ubicados al oeste (Reparo, Las Grutas, Bajo Oliveira y El Sótano) respecto del ubicado al este (Orengo). Las prevalencias más altas se registraron durante el otoño entre 1996 y 1999, y generalmente en primavera, entre el 2000 y el 2001. Los valores máximos (alrededor del 50 – 60%) se obtuvieron en los lotes cultivados y en los bancos Reparo y Las Grutas en 1997, simultáneamente con los registros de las máximas mortalidades en los cultivos. Los valores mínimos de prevalencia (3%) se registraron durante el 2000 y el 2001, en los bancos más alejados de la zona de cultivo: Bajo Oliveira y Orengo.
Bivalve mollusks are sedentary organisms that can establish an intimate relationship among them and with their environment. Their wild populations are hosts for different pathogens (virus, bacteria, fungus, protozoan and metazoan) whose presence is regulated in nature exceptionally causing, severe impacts. At commercial scale, concentration of specimens under culture provokes alterations of natural equilibrium between parasites and host, generating conditions for the appearance of illness. Between 1995 and 1996, a company settled in Bay of San Antonio (Rio Negro, Argentina), beginning the first commercial culture of the native flat oyster Ostrea puelchana D’Orbigny. At 18 months from the beginning of the culture, abnormal mortalities were detected which affected the 95% of the specimens along one year. When histological analysis were performed on cultured and wild oysters, the presence of a “Bonamia-like” parasite was observed. This thesis show results of studies carried out on wild and farmed populations of the native flat oyster, O. puelchana in the Gulf San Matías (Río Negro). Studies were done between 1996 and 2002 with the purpose of detect, identify and characterize the agent associated with mortalities in the farming area. In September 1996 and October 1997 samples from the commercial culture of O. puelchana in San Antonio Bay were collected. At the same time and, until October 1998, samplings during autumn and spring were carried out at the natural beds Reparo and Las Grutas. From March 1999 until October 2001, other 3 natural beds were sampled: El Sótano, Bajo Oliveira and Playa Orengo. All the samples (n=30) were taken by scuba diving. For detection and determination of Bonamia sp., the following diagnostic techniques were employed: cytological (imprints of heart), histological (histological sections) and molecular methods (Polimerase Chain Reaction and in situ Hybridization). Epidemiological methods were used to validate the diagnostic methods. Also, parasitological parameters and non parametrical and parametrical tests were used to characterize the population dynamics of infection. Some oysters presented gill lesions such as indentations or necklines that partially compromised the lamellae, this is the main macroscopic sign and the only statistically significant about the presence of illness. Over 300 individuals analyzed, coming from Reparo bed, 23% presented gill lesions with different levels of severity, and 10% were parasitised. Exceptionally, the digestive gland was abnormally clear or pale. The presence of haemocytic infiltrations within connective tissue, as well as around the digestive complex and gills, could be detected and parasitised haemocytes could be observed with intracellular parasites (from 1 to 7 per haemocyte). Also, free Bonamia-like cells in intercellular space can be observed, probably liberated from broken haemocytes. Two cellular types of Bonamia sp.: basophilic form and acidophilus form can be distinguished. The former has a spherical or ovoid form, basophilic cytoplasm and a central eosinophilic nucleus; it measures approximately 2 to 5 Sm in diameter. The latter were 3 a 5Sm in diameter, are slightly basophilic and/or acidophilus, rounded with irregular borders and a central nucleus strongly acidophilus. Although, the two types can be found in autumn and spring, basophilic form was more frequently observed in autumn and acidophilus form, mainly in spring. In samples of cultured oysters from September of 1996 and October of 1997, only the former were observed. This latter type of cells was the dense or resistance forms observed in other Bonamia species, and probably were the principal form of dissemination of the illness in the populations. Polymerase Chain Reaction (PCR), performed with Bonamia genus-specific assays produced amplicons of infected oysters that had been identified by histology. In situ Hybridization, with Bonamia-specific probes, produced binding only to structures identified as Bonamia in histological sections, confirming these cells to be Bonamia sp.. Sequencing of PCR products from infected oysters yielded a single SSU rDNA sequence that was clearly a Bonamia sp. The combination of morphology, Bonamia-specific PCR diagnostics, DNA sequence data, and in situ Hybridization with Bonamia sp. DNA probe confirm that the parasite in O. puelchana from culture and naturals beds of San Matías Gulf is a species of Bonamia (Protozoa, Haplosporidia). Evaluation of the four diagnostic techniques to detect Bonamia sp. in O. puelchana by epidemiological methods and the kappa statistics shows imprints of heart and histological sections are equally good, with the former more specific and the latter, more sensitive. Values of kappa for Polimerase Chain Reaction and in situ Hybridization show a good agreement between traditional and molecular methods. Infection of Bonamia sp. is independent from sex host and, generally independent from height host. Moreover, the 47,5% of parasitized females were in spawning stage. The infection apparently follows a clearly pattern that coincides with the start of the female phase. This suggests that the spread of infection is related to spawning condition. The parasitism by Bonamia sp. shows a clear temporal and spatial pattern with infection spreading from cultures to natural beds of San Matías Gulf. Infection starts in cultured area and disseminates to southeast and northwest in the Gulf, although propagation pattern is similar, significant differences could be detected between prevalence of western natural beds (Reparo, Las Grutas, Bajo Oliveira y El Sótano) and eastern one (Orengo). Maximum prevalences were registered during autumn between 1996 and 1999, and during spring between 2000 and 2001. The maximum values (50%–60%) were recorded in the cultivated lots and in Reparo and Las Grutas natural beds in 1997, at the same time maximum mortalities were registered in the cultured area. The minimum prevalence (3%) was registered during 2000 and 2001, in the beds far from the cultivation area: Bajo Oliveira and Orengo beds.
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| Tipo: |
Theses and Dissertations
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| Idioma: |
Espanhol
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| Identificador: |
http://hdl.handle.net/1834/5244
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| Formato: |
149
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| Direitos: |
http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/
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